Chymosine-Käseherstellung

Chymosine – Labenzyme - Milchgerinnungsenzyme Milchwirtschaft

In der Milchwirtschaft sind zwei Lebensmittelenzyme von besonderer Bedeutung

a) Enzyme zur Dicklegung der Milch für die Käsegewinnung

b) Enzyme zum Abbau der Lactose in Milch und Milcherzeugnissen

Chymosine – Labenzyme - Käseherstellung

Weltweit wurden 2020 ca. 20 Mill. Tonnen Käse aus Kuhmilch gewonnen; auf die Europäische Union entfallen 10,4 Mill t und auf Deutschland 2,6 Mill t. Der entscheidende wirtschaftliche Schritt bei der Käseherstellung ist die Dicklegung der Milch. Dies erfolgt fast ausschließlich mit Hilfe zugesetzten Enzymen, den Milchgerinnungsenzymen. Anwendung finden letztlich drei Gruppen von Lebensmittelenzymen.

1. Chymosine (Labenzyme) tierischen Ursprung, meist aus Kälbern, Lämmern und Zicklein.

2. Chymosine (Labenzyme) pflanzlichen Ursprungs. Diese Lebensmittelenzyme spielen in der gewerblichen Anwendung nur eine

untergeordnete Rolle. Sie werden meist für besondere Arten von Käsen oder für regionale Spezialitäten verwendet.

3. Chymosine (Labenzyme) mikrobiellen Ursprungs. Hierbei wird unterschieden zwischen Lebensmittelenzymen aus nicht

gentechnisch-veränderten Mikroorganismen und solchen aus gentechnisch veränderten. Aus letzteren werden naturidentische

Chymosine tierischen Ursprungs gewonnen.

Unter den Chymosinen ist sicherlich das Labenzym aus dem Kälbermagen das Bekannteste. Das Enzym wird in der Mukosa des Labmagens von säugenden Kälbern synthetisiert und dient hier gemeinsam mit Pepsin zur bessern Verdaulichkeit des Milchcaseins. Mit zunehmendem Alter der Kälber nimmt die Synthese des Labenzyms ab. Das Kälberlab (Chymosin EC 3.4.23.4) gehört zu der Gruppe der Aspartylpeptidasen, eine Gruppe von Endopeptidasen bei denen eine Asparaginsäure im aktiven Zentrum an der Katalyse beteiligt ist. . Das Enzym kommt in zwei Isoformen A und B vor, die sich in ihrer Primärstruktur nur in der Position 244 unterscheiden. Die A-Form (Asparaginsäure anstatt Glycin) weist eine etwas höhere Spezifität für Casein auf, ist jedoch weniger stabil als die B-Form. Chymosin A kann autokatalytisch in zwei Polypeptidketten gespalten werden, es entsteht das Chymosin C. Es weist die geringste Aktivität gegenüber Casein auf. Das Kälberlab wird von 323 Aminosäuren aufgebaut und besitzt eine molekulare Masse von 35,6 kDa.

Das Labenzym hydrolysiert Peptidbindungen in Proteinen, wobei die bevorzugte Spaltung (-spezifität) im Casein an Peptidbindung – Ser-Phe¹⁰⁵ und Met¹⁰⁶ -Ala erfolgt. Sein pH-Aktivitätsoptimum liegt im leicht sauren Bereich (pH 3,5 – 4,0). Das Kälberlab wird von 323 Aminosäuren aufgebaut und besitzt eine molekulare Masse von 35,6 kDa. Das Enzym kommt in den zwei Isoformen A und B vor. Es in der Mukosa als Prä-Pro-Protein synthetisiert. Die Prä-Sequenz wird zum Ausschleusen des Proteins über die Zellmembranen benötigt und dabei abgespalten. Die Prosequenz (oder auch Propeptid genannt) wird zur Aktivierung und Konformationsausbildung des Labenzym benötigt. Durch die Autokatalyse (-hydrolyse) im sauren Milieu erfolgt die Aktivierung.

In käuflich erhältlichen Kälberlabenzymen bestehen durchschnittlich aus 40% der A-Form und 60% der B-Form und enthalten stets auch Pepsin.

Die Labenzyme aus Lamm und Zicklein weisen sehr große Sequenzhomologien zum Kälberlab auf und ähneln ihm auch in den enzymatischen Eigenschaften.

Die Verwendung pflanzlichen Labs hat heute eher traditionelle und regionale Gründe. Sie werden hier häufig zur Käseproduktion aus Schaf- und Ziegenmilch herangezogen.

Käseherstellung

Für die Käseherstellung wird pasteurisierte Milch verwendet (Ausnahme Rohmilchkäse). Diese Milch wird als Kesselmilch aufbereitet. Hierbei erfolgt eine Wärmebehandlung, Einstellung des Fettgehalts und die Zugabe von bestimmten Mikroorganismen-Kulturen. Dies ist der erste Schritt der Standardisierung für eine bestimmte Käseart.

Der zweite erfolgt in den Dicklegung dieser Kesselmilch durch die Zugabe des Chymosins (Labenzyms), der Temperatureinstellung, der Zeitdauer der Enzymeinwirkung und dem Schneiden des Käsebruchs. Bei der weiteren Aufarbeitung wird der feste Käsebruch (Käsestoff) von der Molke getrennt. Hierbei geht ein Großteil (90-95%) des eingesetzten Chymosins (Labenzyms) in die Molke über. Je nach Temperaturführung können bis zu 5% des Chymosins als aktives Enzym im Käsebruch verbleiben.

Die dritte Standardisierung erfolgt im Formen, dem Auspressen weiterer Molke, Salzen, Trocknen und Reifung des Käsebruchs zum Endprodukt Käse. Während der Käsereifung erfolgt eine weitere Proteolyse, die Lipolyse und der Abbau der Lactose.

Prinzipielle Schritte in der Käseherstellung

Dicklegung der Milch – Koagulierung des Caseins

In der Milch liegt das Casein kolloidal gelöst als Micellen vor. Kälberlab und entsprechende Chymosine, die mit Hilfe von gentechnisch veränderten Mikroorganismen gewonnen wurden, spalten im k-Casein ganz spezifisch die Peptidbindung 105 - 106 zwischen den Aminosäuren Phenylalanin und Methionin. Durch diese Hydrolyse wird das hydrophile Glycomakropeptid abgespalten. Sobald etwa 85 % des vorhandenen κ-Caseins hydrolysiert sind, aggregiert das unpolare para-κ-Casein mit den übrigen Caseinen zum Käsebruch.

Die proteolytische Abspaltung des hydrophilen Peptids stellt den Primärschritt des Koagulationsprozesses des Caseins dar. Diese hohe Spezifität dieser Labenzyme ist der große Vorteil für die Gewinnung des Käsebruchs und in der weiteren Reifung des Käses. Labenzyme (Labersatzstoffe) aus Mikroorganismen und Pflanzen besitzen nicht diese hohe Spezifität; sie spalten auch andere Peptidbindungen im Casein. Dies führt zu Caseinverlusten während der Dicklegung und reduziert damit die Käseausbeute. Zusätzlich können während der Käsereifung Bitterpeptide entstehen, die zu Geschmacksveränderungen führen.

Die Nachteile von Labersatzstoffen und der zunehmende Mangel an Kälberlab waren der Anlass zur Klonierung des Gens in Mikroorganismen und zur fermentativen Gewinnung des Kälberlabs.

gmo-Chymosine – Gentechnik

Terminologie:

● Im Folgenden wird der sperrige Satz „Chymosine, die mit Hilfe von gentechnisch veränderten

Mikroorganismen hergestellt werden, durch gmmo-Chymosine ersetzt. gmmo-Lebensmittelenzym

wird hier gleich bedeutet zur „produced with….“ aus VO (EG)1829/2003 angesehen.

● gvo-Lebensmittelenzym soll hier bedeuten: hergestellt aus einem gentechnisch veränderten

Organismus.

● Der Term „gentechnisch verändertes Lebensmittelenzym“ wird hier nicht genutzt., da das Enzym

selbst nicht verändert wurde, sondern der Produktionsorganismus.

Gentechnische Gewinnung von Kälberlab

Wie bei allen höheren Organismen ist auch das Strukturgen für das Labenzym des Rindes komplex aufgebaut. Die Größe des Gens wird mit ± 10500 Basenpaare (bp) angegeben. Es enthält neun Exons und acht Introns (nicht kodierende Bereiche). Das Präprochymosin umfasst 1143 bp, das Prochymosin 1095 bp und das Chymosin 969 bp. Aufgrund der Exon-Intron-Struktur musste für die Klonierung des Gens zunächst die für das fertige Präprochymosin codierende mRNA isoliert werden. Diese wiederum wurde dann mit der reversen Transkriptase in den RNA-DNA-Hybriddoppelstrang überführt. Ein RNA-Verdau führte dann zu cDNA. Diese enthält nun keine nichtkodierenden Bereiche und führt letztlich zu dem Präproprotein mit der „richtigen“ Aminosäurensequenz. Diese cDNA bzw. die dcDNA wurde dann weiter für die Synthese des Prochymosins in ein entsprechendes Expressionsplasmid überführt. Je nachdem welche mRNA isoliert wurde, kann das Chymosin A oder das Chymosin B gewonnen werden.

Erstmals wurde das Chymosin A mithilfe von Escherichia coli K-12 von Pfizer kommerziell gewonnen. In E. coli wird das Proenzym nach seiner Synthese in „inclusion bodies“ im Zellinneren eingeschlossen. Nach Aufschluss der Zelle werden diese Einschlusskörperchen aufgereinigt und das Prochymosin im Sauren aktiviert. Für das aktive Enzym, das Chymosin A, erfolgt ein weiterer chromatographischer Reinigungsschritt.

Die Expression in E. coli hat einen gewissen Nachteil; das Produkt wird nicht in seiner aktiven Form direkt ins Fermentationsmedium ausgeschieden. Weitere Aufarbeitungsschritte sind notwendig.

Dies wurde z. B. mit der Expression des Prochymosin-Gens in Aspergillus niger var. awamori umgangen. Hier wurde das Prochmyosin B-Gen mit dem Glucoamylase-Gen aus A. niger fusioniert und die Expression steht unter der Kontrolle des Glucoamylase Promotors. Das Fusionsprotein wird während der Fermentation über Signalpeptid der Glucoamylase in das Medium sezerniert. Hierbei wird das Fusionsprotein unter den Fermentationsbedingungen hydrolysiert und das Chymosin B in seiner aktiven Form freigesetzt. Nach Separierung der Biomasse wird das Chymosin B chromatographisch aufgereinigt.

Heute erfolgt die direkte chemische Synthese des Prochymosin-Gens, wobei hier gleich die “Codon Usage“ für den Empfängerorgansimus optimiert wird.

Alle biochemischen und enzymologischen Untersuchungen zeigten, dass diese fermentativ gewonnenen Rinderlabenzyme identisch zu denen aus dem Kälbermagen sind. Die toxikologischen Daten weisen diese gmmo-Chymosine als unbedenklich für den menschlichen Verzehr aus.

Ende der 80-ziger Jahre des letzten Jahrhunderts standen folgende gmmo-Chymosine

● Chymosin A - Escherichia coli K-12

● Chymosin B - Aspergillus niger var. awamori

● Chymosin B - Kluyveromyces lactis

zur Verfügung.

Heute wird zusätzlich noch das Labenzym aus dem Kamelmagen fermentativ gewonnen.

Allen diesen gmmo-Chymosinen ist gemeinsam, dass

● sie ausschließlich das Labenzym und keine weiteren Anteile an anderen Peptidasen enthalten und sie einen hohen Grad an

Reinheit aufweisen. In der Regel enthalten die Enzympräparate 70 – 80 % Chymosin, der Rest verteilt sich auf Kochsalz und

Stabilisatoren.

● sie nach PCR-Analysen weder Spuren von rDNA noch von DNA der Produktionsorganismen aufweisen. Ebenso sind lebende,

vermehrungsfähige Produktionsorganismen in den Präparaten nicht nachweisbar. Beides ist (war) eine Voraussetzung für die

Zulassung zum in Verkehr bringen.

● sie nach VO (EG) 1829/2003 nicht kennzeichnungspflichtig sind.

Die bekanntesten Handelsmarken für gmmo-Chymosine sind: Maxiren® und Maxiren®XDS von DSM und Chym-Max® sowie Chy-Max® M von Chr. Hansen.

Säulenchromatographische Auftrennung von Labpräparaten

links: gmmo-Kälberlab rechts: Kälber-Lab aus dem Kälbermagen

Die Einheitlichkeit des gmmo-Chymosins ist evident!

Verwendung von gmmo-Chymosinen

Weltweit wurde 1988 erstmals das Chymosin B aus Kluyveromyces lactis in der Schweiz zugelassen, gefolgt 1990 von den USA für Chymosin A aus Escherichia coli K-12. In Deutschland werden (wurden) die gmmo-Chymosine gemäß der Käseverordnung als Labaustauschstoffe angesehen. Seit März 1997 haben sie nach der Allgemeinverfügung nach § 47a des LMBG die Genehmigung zum Inverkehrbringen und zur Verwendung. Gmmo-Chymosine sind in den meisten europäischen und außereuropäischen Ländern zugelassen.

Allerdings stehen kaum zuverlässige Daten zu ihrer tatsächlichen Verwendung zur Verfügung. Nach Schätzungen werden in den USA und in Großbritannien 80-90% der Käse mit gmmo-Chymosine hergestellt. Weltweit hatten mikrobielle Labenzyme bis 2000 einen Marktanteil von etwa 40 %, gmmo-Chymosine etwa 60 %. In Deutschland sollen 60 -70 % der Käse mit mikrobiellen Labenzymen hergestellt werden. Hierbei wird aber differenziert zwischen konventionellen mikrobiellen Labenzymen und gmmo-Chymosinen. Daten sind für Deutschland nicht veröffentlicht. Gmmo-Chymosine dürfen für Käse aus ökologischer Produktion gemäß der Ökoverordnung nicht verwendet werden und bei Betrachtung der weiten Auslobung der Käse mit „ohne Gentechnik“* sollte der Einsatz von gmmo-Chymosinen in Deutschland übersichtlich sein. Aber dennoch ist davon auszugehen, dass es auch in Deutschland verwendet wird.

* Nach den VLOG-Vorgaben darf kein gmmo-Chymosin verwendet werden.

Labaustauschstoff Chymosin ("Chymogen", "Chy-Max" bzw. "Maxiren"). Zu Nr.1997-003-00

Bekanntmachung einer Allgemeinverfügung gemäß § 47 a des Lebensmittel- und Bedarfsgegenständegesetzes über die Einfuhr und das Inverkehrbringen des zur Käseherstellung verwendeten Labaustauschstoffes Chymosin ("Chymogen", "Chy-Max" bzw. "Maxiren"), der mit Hilfe gentechnisch veränderter Organismen hergestellt worden ist.

Zur Käseherstellung verwendeter Labaustauschstoff Chymosin ("Chymogen", "Chy-Max" bzw. "Maxiren"), der in einem anderen Mitgliedstaat der Europäischen Gemeinschaft oder einem anderen Vertragsstaat des Abkommens über den Europäischen Wirtschaftsraum rechtmäßig mit Hilfe gentechnisch veränderter, hinsichtlich des Fehlens von chronisch-toxischen, karzinogenen, teratogenen, mutagenen oder sonst gesundheitlich bedenklichen Eigenschaften als gesundheitlich unbedenklich eingestuften Aspergillus niger var. awamori, Escherichia coli und Kluyveromyces lactis hergestellt und rechtmäßig in den Verkehr gebracht wird oder aus einem Drittland stammt und sich in einem Mitgliedstaat der Europäischen Gemeinschaft oder einem anderen Vertragsstaat des Abkommens über den Europäischen Wirtschaftsraum rechtmäßig im Verkehr befindet, darf in die Bundesrepublik Deutschland verbracht und hier in den Verkehr gebracht werden.

https://www.bvl.bund.de/DE/Arbeitsbereiche/01_Lebensmittel/04_AntragstellerUnternehmen/07_Allgemeinverfuegungen/01_Archiv_Uebersicht/06_Kaese/lm_av1997_003_00_basepage.html

Lipasen werden zur Unterstützung der Lipolyse während der Käsereifung eingesetzt. Sie dienen zur Unterstützung der Aromaausbildung oder schnelleren Reifung.

Kennzeichnung von Labenzymen und Labaustauschstoffen - Zutatenverzeichnis

Lebensmittelenzyme sind nach der Enzymverordnung VO (EG) Nr. 1332/2008 von einer Kennzeichnung und der Verpflichtung einer Nährwertkennzeichnung ausgenommen, sofern sie als Verarbeitungshilfsstoffe verwendet werden. Bei der Kennzeichnung von Lebensmittelenzymen greift die ► Informationsverordnung (EU) Nr. 1169/2011. Nach dieser müssen sämtliche Zutaten im Zutatenverzeichnis in absteigender Reihenfolge aufgeführt werden. Kennzeichnungsausnahmen gelten u.a. für Lebensmittelenzyme, wenn sie im Enderzeugnis keine technologische Wirkung mehr haben.

Nach der LMIV (RU) Nr. 1169/2011, §19 ist bei einigen Milchprodukten kein Zutatenverzeichnis erforderlich:

“Käse, Butter, fermentierter Milch und Sahne, denen keine Zutat zugesetzt wurde außer für die Herstellung notwendige Milchinhaltsstoffe, Lebensmittelenzyme und Mikroorganismen-Kulturen oder für die Herstellung von Käse — ausgenommen Frisch- oder Schmelzkäse — notwendiges Salz;”

Definition eines Verarbeitungshilfsstoff:

„.., der nicht als Lebensmittel verzehrt wird, bei der Verarbeitung von Rohstoffen, Lebensmittel oder deren Zutaten aus technologischen Gründen während der Be- oder Verarbeitung verwendet wird und unbeabsichtigte, technologisch unvermeidbare Rückstände des Stoffes oder seiner Derivate im Enderzeugnis hinterlassen kann, sofern diese Rückstände gesundheitlich unbedenklich sind und sich technologisch nicht auf das Enderzeugnis auswirken."

VO (EG) Nr. 1333/2008, Art. 3, Abs. 2, 1

Die Lebensmittelüberwachung in Deutschland beanstandet zunehmend bei Weich- und Hartkäse, dass im Zutatenverzeichnung die Verwendung von Labenzymen und / oder Labersatzstoffe nicht angegeben wurden. In der 76. Sitzung des ALTS wurde wurde hierzu festgestellt und beschlossen:

Bei Lab bzw. Labaustauschstoffen handelt es sich um Lebensmittelenzyme. Diese werden der Käsereimilch beider Käseherstellung direkt zugesetzt und mit der Milch vermengt. Die erzielte Auswirkung auf das Enderzeugnis ist evident: Ohne Lab bzw. Labaustauschstoff wäre aus der flüssigen Milch kein fester Käse geworden. Lab bzw. Labaustauschstoff werden daher nicht wie ein Verarbeitungshilfsstoff, sondern wie ein Zusatzstoff verwendet. Damit sind Lab bzw. Labaustauschstoff nach Art. 18 der VO (EU) Nr. 1169/2011 im Zutatenverzeichnis anzugeben.

https://www.bvl.bund.de/SharedDocs/Downloads/01_Lebensmittel/ALS_ALTS/ALTS_Beschluesse_79_Arbeitstagung_Jun_2017.pdf?__blob=publicationFile&v=3

Der ALTS schließt richtig, dass Lab und Labaustauschstoffe Lebensmittelenzyme sind, die aus technologischen Zwecken - zur Milchgerinnung - zugesetzt werden und kommt daher zum Schluss, dass sie Zusatzstoffe seien. Er verkennt aber die Definition eines Verarbeitunghilfsstoffes: Lab und Labaustauschstoffe haben im Endprodukt - dem Käse - ihre technologische Funktion der Dicklegung der Milch verloren.

Hersteller wie Verbraucher sind verunsichert! Mit Verabschiedung der Unionsliste für Enzyme sollte die Kommission auch den Status von Labenzymen und Labaustauschstoffen klären.

Gegenwärtig findet man auf den Zutatenlisten von Käsesorten sowohl keine Angabe als auch eine Angabe über die Verwendung dieser Lebensmittelenzyme.

EU-Kommission und EFSA-Bewertung

Für alle relevanten Aspartylpeptidasen (EC 3.4.23. - ) bzw. Lebensmittelenzyme für die Käseherstellung liegen bei der Kommission Anträge zur Eintragung in die Unionsliste vor. Für das traditionelle Kälberlab (Rennet) wurde ein „Joint Dossier“ mehrerer Hersteller eingereicht. Keines dieser Lebensmittelenzyme wurden bislang von der EFSA bewertet (Stand 10.02.2021). Die nachfolgenden Listen zu den Labenzymen und Labersatzstoffen werden jeweils nach Fortgang der Bewertungen durch die EFSA aktualisiert.